本发明的目的在于提供一种方便、高效、重复性好的提取液体样本总RNA的试剂和方法,包括从来源于人、动物、植物等任何液体形式的样品中提取总RNA。本发明提供的一种提取液体样本总RNA的试剂,其组分按重量份数计:异硫氰酸胍10~50份,醋酸5~20份,醋酸钠10~30份,苯酚10~50份,硫氰酸铵5~20份,十二烷基肌氨酸钠0.1~10份。本发明提供的液体样本总RNA提取方法,不需要在处理样本前离心去除液体的步骤,对于全血样本来说,不需要分离红细胞和白细胞,不需要进行另外的红细胞裂解步骤。整个过程操作简单,方便快捷。采用本发明获得的总RNA产品得率高,稳定性好,可以满足下游分子生物学实验。
1.一种从液体样本中快速提取总RNA的试剂,其特征在于:其组分按重量份数计包括:异硫氰酸胍10~50份,醋酸5~20份,醋酸钠10~30份,苯酚10~50份,硫氰酸铵5~20份,十二烷基肌氨酸钠
0.1~10份。
2.按照权利要求1所述的一种从液体样本中快速提取总RNA的试剂,其特征在于:所述液体样本包括来源于人、动物、植物、酵母、细菌、病毒培养液的液体形式的样品。
3.一种用权利要求1所述的试剂从液体样本中快速提取总RNA的方法,其特征在于包括如下步骤:步骤[1]按照3:1的体积比加入权利要求1所述试剂和液体样本后震荡混匀,室温下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解;步骤[2]按照每0.75~1mL步骤[1]中加入的权利要求1所述试剂加入0.2mL氯仿,然后剧烈震荡并在室温下孵育5分钟帮助有机相和水相分层;步骤[3]4°C12000rpm下离心经所述步骤[2]后所得的混合液15分钟,然后取含有RNA的上层水相;步骤[4]在经所述步骤[3]后所得的含有RNA的水相中加入异丙醇,加入的量按照每0.75~1mL步骤[1]中加入的权利要求1所述试剂加入0.5mL计算,然后室温孵育10分钟使RNA沉淀;步骤[5]4°C12000rpm下离心经所述步骤[4]后所得的混合液10分钟,然后弃上清;步骤[6]用75%乙醇漂洗经所述步骤[5]后所得的RNA沉淀;步骤[7]真空干燥经所述步骤[6]后得到的RNA5分钟,然后用Rnase-freexa0H₂O溶解,-80°C下保存。技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域,尤其涉及一种从液体样本中快速提取总RNA的试剂及方法。
背景技术
近年来,在基因研究的相关技术中,作为生物体内重要遗传物质,RNA已越来越多的成为被研究的对象。总RNA的提取是分子生物学研究的基础,在进行实时荧光定量PCR、cDNA文库的构建等分子生物学实验时均需要高质量RNA,因此RNA的提取是分子生物学研究的一个关键步骤。有关动植物组织中RNA提取方法的报道已经很多,常用的RNA的提取方法有TRIZOL法、异硫氰酸胍法、CTAB-LiCL法及国内外各生物公司的总RNA提取试剂盒等。目前普遍使用的是根据RNA在酸性酚溶液中的溶解度不同,组织或细胞用变性液处理后,在用酸性酚和氯仿抽提的酸性硫氰酸胍-酚-氯仿一步法,该方法的优点是具有强烈的蛋白变性剂,它能强烈抑制材料及提取液中的Rnase的活性。早在1987年Chomaczynski等就建立了异硫氢酸胍/苯酚/氯仿一步法提取总RNA,该方法得到了广泛应用,数家公司据此开发出RNA提取试剂盒。然而液体样本中总RNA提取一直是一个比较困难的问题,因为液体样本本身大多都是水,RNA含量少,所以提取RNA相对较为困难。现在大部分血液总RNA的提取方法都需要分离红细胞和白细胞,然后裂解红细胞,倒掉上清液,再从白细胞中提取总RNA,最后还要用DNase酶进行基因组DNA的消化,整个操作时间甚至需要几个小时才能完成,即使有RNA提取出来,大都也都降解了。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种使用方便高效、重复性好的快速提取液体样本总RNA的试剂和方法,所述液体样本包括来源于人、动物、植物、酵母、细菌、病毒培养液等任何液体形式的样品。为解决上述技术问题,本发明所采用的技术方案如下:本发明所述的从液体样本中快速提取总RNA的试剂,其组分按重量份计包括:异硫氰酸胍10~50份,醋酸5~20份,醋酸钠10~30份,苯酚10~50份,硫氰酸铵5~20份,十二烷基肌氨酸钠0.1~10份。本发明提供的一种用上述试剂从液体样本中快速提取总RNA的方法,其特征在于包括如下步骤:步骤[1]按照3∶1的体积比加入所述试剂和液体样本后震荡混匀,室温下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解;步骤[2]按照每0.75~1mL步骤[1]中加入的本发明所述试剂加入0.2mL氯仿,然后剧烈震荡并在室温下孵育5分钟帮助有机相和水相分层;步骤[3]4°C12000rpm下离心经所述步骤[2]后所得的混合液15分钟,然后取含有RNA的上层水相;步骤[4]在经所述步骤[3]后所得的含有RNA的水相中加入异丙醇,加入的量按照每0.75~1mL步骤[1]中加入的本发明所述试剂加入0.5mL计算,然后室温孵育10分钟使RNA沉淀;步骤[5]4°C12000rpm下离心经所述步骤[4]后所得的混合液10分钟,然后弃上清;步骤[6]用75%乙醇漂洗经所述步骤[5]后所得的RNA沉淀;步骤[7]真空干燥经所述步骤[6]后得到的RNA5分钟,然后用Rnase-freexa0H₂O溶解,-80°C下保存。本发明的积极效果在于:本发明所述试剂中含有强烈的蛋白变性剂,能迅速变性蛋白,使RNase变性,不能对RNA降解。使用本发明所述的方法能够更加快速方便的提取液体样本中的总RNA,且重复性好,省去了在处理样品前离心去除液体的步骤,对于血液样本,用上述试剂和方法无需分离红细胞,直接对血液进行裂解,既简化步骤,又避免白细胞的损失,总RNA产品得率高,稳定性好,且其裂解后得到的混合液还可以用来运输所提取RNA,以避免在运输过程中RNA的降解。
附图说明
图1为按照下述实施例1提取人的全血总RNA的琼脂糖凝胶电泳图;泳道1与2:全血样本在-80°C保存一个月后的提取结果;泳道M:标准的Hela细胞RNA。图2为利用实验室常用方法和下述实施例2中的方法提取鸡胚成纤维细胞总RNA的琼脂糖凝胶电泳图;泳道1:利用实验室常用方法提取的RNA;泳道2:利用实施例2所述方法提取的RNA;泳道M:Marker。图3为按照下述实施例3所述方法提取的HIV-1RNA进行RT-PCR实验的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种从液体样本中快速提取总RNA的试剂及方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们应当都被视为包括在本发明中。本发明的试剂及方法已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明的内容、精神和范围内对本文所述的试剂和方法进行改动或者适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。本发明所述的从液体样本中提取总RNA的试剂,其组分按重量份计包括:异硫氰酸胍10~50份,醋酸5~20份,醋酸钠10~30份,苯酚10~50份,硫氰酸铵5~20份,十二烷基肌氨酸钠0.1~10份。其中作为优选,按重量份数计,异硫氰酸胍30份,醋酸12份,醋酸钠20份,苯酚30份,硫氰酸铵12份,十二烷基肌氨酸钠5份,充分溶解后常温保存。本发明所述的液体样本包括来源于人、动物、植物、酵母、细菌、病毒培养液等任何液体形式的样品。本发明所述的从液体样本中快速提取总RNA的方法,包括如下步骤:步骤[1]按照3∶1的体积比加入所述试剂和液体样本后震荡混匀,室温下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解;步骤[2]按照每0.75~1mL步骤[1]中加入的本发明所述试剂加入0.2mL氯仿,然后剧烈震荡并在室温下孵育5分钟帮助有机相和水相分层;步骤[3]4°C12000rpm下离心经所述步骤[2]后所得的混合液15分钟,然后取含有RNA的上层水相;步骤[4]在经所述步骤[3]后所得的含有RNA的水相中加入异丙醇,加入的量按照每0.75~1mL步骤[1]中加入的本发明所述试剂加入0.5mL计算,然后室温孵育10分钟使RNA沉淀;步骤[5]4°C12000rpm下离心经所述步骤[4]后所得的混合液10分钟,然后弃上清;步骤[6]用75%乙醇漂洗经所述步骤[5]后所得的RNA沉淀;步骤[7]真空干燥经所述步骤[6]后得到的RNA5分钟,然后用Rnase-freexa0H₂O溶解,-80°C下保存。为进一步理解本发明,下面结合实施例对本发明提取RNA的方法进行详细说明。实施例1:本发明所述从液体样本中快速提取总RNA的试剂按重量份数计,取异硫氰酸胍30份,醋酸12份,醋酸钠20份,苯酚30份,硫氰酸铵12份,十二烷基肌氨酸钠5份,充分溶解后常温保存。利用上述配方配置的试剂按照本发明中所述快速提取总RNA的方法提取人全血RNA。实施例2:本发明所述从液体样本中快速提取总RNA的试剂按重量份数计,取异硫氰酸胍10份,醋酸5份,醋酸钠10份,苯酚10份,硫氰酸铵5份,十二烷基肌氨酸钠0.1份,充分溶解后常温保存。利用上述配方配置的试剂按照本发明中所述快速提取总RNA的方法提取人全血RNA。实施例3:本发明所述从液体样本中快速提取总RNA的试剂按重量份数计,取异硫氰酸胍50份,醋酸20份,醋酸钠30份,苯酚50份,硫氰酸铵20份,十二烷基肌氨酸钠10份,充分溶解后常温保存。利用上述配方配置的试剂按照本发明中所述快速提取总RNA的方法提取人全血RNA。按照上述实施例1、实施例2及实施例3所述的试剂处理相同的人全血样本,进行比较。检测值如下表:xa0xa0吸光度
xa0xa0A260/A280
xa0xa0得率
xa0xa0实施例1
xa0xa01.8
xa0xa018ug/mL
xa0xa0实施例2
xa0xa01.8
xa0xa010ug/mL
xa0xa0实施例3
xa0xa01.8
xa0xa013ug/mL
实施例4:本发明所述液体样本中快速提取总RNA的方法在临床上采血时,先把本发明实施例1所述试剂分装750uL到1.5ml的离心管中。血液样本先经过抗凝处理(EDTA抗凝或者其他抗凝方式都可),然后取250uL全血样品加入到750uL的上述试剂中,用移液枪反复抽打并振荡混匀,在室温裂解5~10分钟,直至血细胞充分发生裂解。如果没有立刻实验,此裂解液可以保存在-20°C下可达2个月,-80°C可达半年。在上述裂解液中加入200uL氯仿剧烈震荡并在室温下孵育5分钟帮助有机相和水相分层;4°C12000rpm离心15分钟后取上层水相;在含有RNA的水相中加入异丙醇室温孵育10分钟使RNA沉淀;4°C12000rpm离心10分钟后去弃上清;用75%乙醇漂洗得到的RNA沉淀;真空干燥5分钟后用Rnase-freexa0H₂O溶解,-80°C保存。其中所提取RNA的琼脂糖凝胶电泳检测如图1所示,可以看出使用该试剂和方法用于全血有核细胞的RNA提取效果较好,可以满足基因表达谱芯片的分析要求。实施例5:本发明所述液体样本中快速提取总RNA的方法在直径为3.5cm的鸡胚成纤维细胞培养板中加入本发明实施例1所述试剂400uL,用加样枪吹打混合样品若干次后分次转移裂解物到2mL离心管;加入106uL氯仿后震荡混匀并在室温下孵育5分钟帮助有机相和水相分层,于4°C12000rpm离心15分钟;离心后混合物分为3层:下层有机相,中间层,上层水相;将含有RNA的水相转移至新离心管,加入267uL异丙醇室温孵育10分钟使RNA沉淀,4°C12000rpm离心10分钟后去弃上清,用75%乙醇漂洗得到的总RNA沉淀。真空干燥5分钟。将上述总RNA沉淀溶解于100uL无RNA酶的水中。分光光度计检测得到OD260/OD280比值在1.8~2.0之间,平均1mg的细胞可以得到10μg左右的totalxa0RNA,足够满足下游实验的需要。其中所提取RNA的琼脂糖凝胶电泳检测如图2所示。使用本发明所述试剂和方法用于细胞总RNA提取效果较好,在总RNA量和提取时间上都优于其它方法。实施例6:本发明所述液体样本中快速提取总RNA的方法利用本发明实施例1所述试剂进行HIV-1RNA提取及下游的RT-PCR实验。本次共检测10例样本,方法如下:取一支容积为1.5ml无RNA酶管,分别加入本发明所述试剂750ul,Carrierxa0RNA4ul,病毒样本250ul。室温孵育10分钟,加入150ul氯仿,室温孵育3分钟。12000rpm,4°C离心10分钟。将上层富含RNA液转入另一个新的2.0ml的无RNA酶管中,加入0.5ml异丙醇,室温孵育10分钟,12000rpm,4°C离心10分钟。去掉上清,加入700ul的70%乙醇漂洗两次,12000rpm,离心1分钟。去掉上清,风干RNA5~10分钟后,用Rnase-freexa0H₂O溶解。获得的RNA溶液进行RT-1PCR反应。PCR结果用琼脂糖凝胶电泳检测如图3所示。